大肠杆菌是生物医疗领域中应用最广泛的工程菌之一，因其生长速度快、培养成本低以及成熟的基因克隆表达系统而受到青睐。其质粒常被用作基因工程的载体，广泛应用于基因的分子克隆、疫苗研发以及重组蛋白类药物的生产等领域。然而，在这些应用中，必须严格控制相关生物制品中内毒素的残留水平。

内毒素简介

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁最外层的成分，覆盖在细胞壁的黏肽上，其化学结构为磷脂-多糖-蛋白质复合物。主要的毒性成分为脂多糖（LPS）中的类脂A，内毒素通常在细菌死亡、细胞溶解或用人工方法破坏细胞后释放。内毒素能直接影响人体，激活宿主细胞上的Toll样受体（TLR），引发炎症反应，导致发热和全身性的炎症反应，甚至可能引起弥散性血管内凝血、休克及多脏器功能衰竭等严重病理症状。因此，内毒素又被称为“热原”。其生物活性极强，即使微量也会引发多种炎症反应和免疫应答。此外，内毒素还具有良好的耐热性，需在180℃下加热3小时以上才能完全灭活，一般的化学药品通常不会影响其活性，只有强酸、强碱或强氧化剂才能破坏其结构。

内毒素的检测方法

内毒素可以与特定检测试剂发生反应，因此开发了多种检测方法。常见的检测方法包括凝胶法、重组C因子法和动态比浊法等。鲎试剂中的C因子是一种对内毒素敏感的蛋白，能够结合内毒素并激活鲎试剂的血凝级联反应。凝胶法依据此原理，通过观察是否形成凝集素来判断内毒素的存在，该方法操作简便，无需光学检测仪，但其检测范围有限。随着对鲎的保护以及重组技术的发展，新一代人工合成的重组C因子陆续投入使用。重组C因子在内毒素活化后能与荧光底物反应，产生荧光信号，信号强度与内毒素浓度呈正比关系，从而可用于精准检测。同时，动态比浊法通过光学测定仪监测反应混合物达到预定OD值的时间和浊度变化，提供的数据不仅有助于产品质量追踪，还能起到风险预警的作用。

内毒素的去除方法

由于内毒素的显著危害性，FDA等法规对其控制提出了明确要求。首先，要从源头消除外源性内毒素污染，确保生物药物研发及生产过程中，直接接触样品的设备、容器、储液袋、原辅料及耗材等经过严格消毒和灭菌处理。其次，对于样品中存在的内源性内毒素污染，需要从样品制备工艺入手，采用合适的去除方法，如离子交换层析法、疏水层析法和特异性吸附等。

- 离子交换层析法：根据目标产物与内毒素在缓冲液中的电荷差异，利用离子交换层析去除内毒素。阴离子交换层析通过调节缓冲液的离子强度使内毒素带负电，结合正电荷配基实现去除；阳离子交换则通过改变缓冲液的pH让带正电的目的蛋白吸附在介质上，将带负电的内毒素流出。

- 疏水层析法：内毒素在高盐条件下聚集成不与疏水填料结合的复合物，上样时直接流过被去除。或者通过调节盐浓度，在一定条件下使目的蛋白不与填料结合而内毒素可与其结合，实现分离。

- 特异性吸附：使用多粘菌素B偶联的层析介质，通过介质特异性吸附内毒素，而目的蛋白则随流动相流出，收集该流出蛋白。虽然该方法对去除内毒素的效果良好，但会伴随一定的蛋白损失。此外，还可基于内毒素在不同水溶液中聚集体分子量的差异，利用凝胶过滤层析和切向流膜过滤等技术进行去除。

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